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La Galleria ha sede in uno dei più noti e significativi complessi architettonici del primo Quattrocento fiorentino, edificato per volontà dell'Arte della Lana ad opera di Filippo Brunelleschi. Lo "Spedale" era destinato ad accogliere fanciulli abbandonati che venivano allevati ed istruiti in qualche mestiere che permettesse loro di inserirsi nella società. Nell'insieme di refettori, chiostri, dormitori, infermerie, stanze per le balie, portici, il Brunelleschi realizzò un'esempio armonico ed equilibrato di razionale architettura ospedaliera, che fu nel tempo ampliata e decorata con affreschi che documentano la lunga attività dell'istituzione e il favore della dinastia regnante, i Medici. La Galleria ha trovato sede adeguata nel loggiato superiore del chiostro e nella ex sala di soggiorno dei fanciulli sovrastante il portico di facciata: è composta di opere pregevoli che rappresentano solo una piccola parte delle cospicue collezioni raccolte attraverso i secoli dallo Spedale con donazioni, lasciti o depositi o con opere eseguite per lo stesso istituto. Dispersi nell'Ottocento i pezzi più importanti (Della Robbia, Beato Angelico, Vasari, Giambologna), quanto rimasto (pur sempre di ottima qualità) comprende dipinti su tavola, affreschi staccati, mobili, arredi e una serie di splendidi codici miniati dei secoli XIV e XV, tra i più preziosi conservati a Firenze. Tra i dipinti più importanti segnaliamo l'Adorazione dei Magi di Domenico Ghirlandaio (1449-1494) eseguita per la chiesa dello Spedale: splendida per ricchezza di colori e di particolari, la tavola vede inseriti tra quanti circondano il Bambino alcuni ritratti dei personaggi storici (mercanti dell'Arte della Seta e inservienti) legati alla vita dello Spedale. Oltre ad alcuni "fondo oro" di pregevole qualità la Galleria possiede anche una Madonna col Bambino attribuita a Botticelli giovane (1445-1510), ancora legato all'influsso del maestro Filippo Lippi; una delle terrecotte invetriate più armoniche di Luca della Robbia; una pala di Piero di Cosimo (1461/62-1521) anche questa eseguita per la chiesa dello Spedale e una caratteristica Madonna degli Innocenti della scuola del Granacci (1469-1543), che copre col suo manto i fanciulli ed ha alle spalle il portico brunelleschiano dello Spedale stesso.
Giovanni Battista Naldini (Pittore) con il dipinto "Pietà con san Girolamo e santi" databile nel periodo 1550 - 1591.
Giovanni del Biondo (Pittore) con il trittico "Annunciazione ; San Nicola di Bari ; Sant'Antonio Abate" databile nel periodo 1375 - 1385.
Giovanni Toscani (Pittore) con il trittico "Madonna con Bambino ; San Girolamo ; Santa Caterina d'Alessandria ; Cristo crocifisso con i dolenti ; Angelo annunciante ; Maria Vergine annunciata ; Pietà" databile nel periodo 1400 - 1430.
Piero di Lorenzodetto Piero di Cosimo (Pittore) con il dipinto "Madonna con Bambino in trono con san Pietro, san Giovanni Evangelista, santa Rosa da Viterbo, santa Caterina d'Alessandria e angeli" databile nel periodo 1488 - 1505.
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